货号：C026/C027

规格：100次/200次

产品简介及说明：

杆状病毒穿梭载体bacmid抽提试剂盒(Baculovirus Shuttle Vector Bacmid Preparation Kit，简称Bacmid Preparation Kit)是一种从大肠杆菌DH10Bac中简单快速抽提高质量可适应用于昆虫细胞转染的bacmid的试剂盒。

1. 主要特点是简单快速，不使用剧毒试剂，无须酚氯仿抽提，无须过柱纯化，有效解决bacmid分子量大、抽提难度高等系列问题，确保抽提获得的bacmid可适用于昆虫细胞转染。

2. 当目的基因被插入到pFastBac系列载体中构建成目的重组质粒后，该重组质粒可用于转化大肠杆菌DH10Bac从而发生位点特异的转座(site-specific transposition)，蓝白斑筛选和PCR鉴定筛选含有重组bacmid的重组子，再使用本试剂盒进行bacmid的抽提即可获得可转染昆虫细胞的bacmid DNA。

3. 本试剂盒在抽提bacmid的同时，也会抽提辅助质粒(helper plasmid)和未重组的pFastBac质粒。抽提获得的bacmid等质粒混合物可以直接用于转染昆虫细胞以包装杆状病毒，最终用于目的蛋白在昆虫细胞中的大量表达。

4. Bac-to-Bac杆状病毒表达系统是由Luckow等人于1993年发展的一种快速而有效产生重组杆状病毒的方法。该系统主要包括以下两个组分：(1)用于插入目的基因的pFastBac载体，目的基因插入后受杆状病毒特异性启动子(baculovirus-specific promoter)调控表达；(2)含杆状病毒穿梭载体bacmid (bMON14272，136kb)和辅助质粒(helper plasmid，用于表达转座必须的转座蛋白)的大肠杆菌DH10Bac宿主菌株。将pFastBac重组质粒转化该菌株可发生pFastBac重组质粒中mini-Tn7元件和bacmid上的mini-attTN7发生转座，从而形成重组的bacmid。

5. 利用Bac-to-Bac杆状病毒感染昆虫细胞产生重组蛋白主要包括以下实验步骤：(1)把目的基因克隆到pFastBac载体产生重组质粒；(2)转化pFastBac重组质粒到DH10Bac大肠杆菌感受态细胞产生重组bacmid；(3)利用杆状病毒穿梭载体bacmid抽提试剂盒提取重组bacmid DNA；(4)将重组bacmid DNA转染进入昆虫细胞以产生重组杆状病毒；(5)扩增重组的杆状病毒并用其感染昆虫细胞以大规模表达重组目的蛋白。

6. 本试剂盒抽提获得的高质量bacmid DNA可以直接用于转染昆虫细胞。

试剂盒清单：

保存条件：室温/2-8°C保存，有效期12个月。

使用说明：

1. 5mL离心管12000rpm离心1min收集细胞。

2. 真空吸干上清，0.3mL的Solution 1重悬沉淀，轻轻地震荡或上下混匀。

3. 0.3mL的Solution 2轻轻混匀，室温孵育5min。注意：悬浮的沉淀应该从浑浊到几乎半透明。

4. 缓慢加入0.3mL KAC，加入过程中轻轻混匀，冰上放置5-10min。

5. 12000rpm离心10min。

6. 轻轻将上清转移到含有0.8mL异丙醇的离心管，不要吸到白色沉淀，颠倒混匀，冰上孵育5-10min。

7. 室温12000rpm离心15min。

8. 小心弃去上清，不要浮起沉淀，加入0.5mL Wash Buffer，颠倒离心管数次清洗沉淀。

9. 室温12000rpm离心5min。重复8和9。

10. 轻轻吸弃上清，室温5-10min干燥沉淀，不要过分干燥。注意：勿使用真空离心选装蒸发仪去干燥DNA。

11. 40μL End Solution重新溶解DNA沉淀，为避免剪切，勿机械重悬DNA，让溶液顺管子轻轻流下溶解DNA。

注意事项：

1. 温度较低时，溶液可能会有沉淀产生。使用前必须检查一遍。如有沉淀，37°C水浴加热溶解，混匀后使用。

2. 请勿过分剧烈混匀溶液，否则会产生大量气泡。

3. 溶液使用完后，请注意盖紧瓶盖，以避免被空气中二氧化碳酸化。

4. 本试剂盒所有操作均在室温进行，操作时无需冰浴。所有离心也均在室温进行，但在4°C进行离心亦可。

5. 尽量避免DNA反复冻融。

6. 本产品仅限于专业人员的科学研究用，不得用于临床诊断或治疗，不得用于食品或药品，不得存放于普通住宅内。

7. 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

常见问题：

1. 转化DH10Bac感受态后平板上没有蓝斑，所有克隆均为白斑：

a. 蓝白斑显色时间不够。需37°C培养至少48h后才能鉴别。

b. 转化后培养时间不够。涂板前转化菌需在SOC培养基中37°C培养至少4h。

c. 平板配置时，忘记加入IPTG和X-gal了。平板须已提前涂好X-gal (90mm平板涂40μL 2% X-gal)并含7μg/mL庆大霉素、100μg/mL卡那霉素、10μg/mL四环素和40μg/mL IPTG。

d. 平板上克隆太多，太密。稀释后涂板。

e. 平板配制时间过久或者存放于有光处。含有多种抗生素的平板超过4个星期通常就不能使用，且需避光保存。

2. 所有克隆都是蓝色：

a. pFastBac1重组质粒质量不好或已降解。使用经过电泳检查的高纯度pFastBac1重组质粒。

b. 可能没加庆大霉素。需严格按照相应方法来配制蓝白斑筛选平板。

3. 克隆数量很少：

a. 转化菌在SOC培养基中培养时间不够。涂板前转化菌需在SOC培养基中至少培养4h。

b. 转化DH10Bac感受态后使用的是LB培养基而不是SOC培养基。需使用SOC培养基至少37°C培养4h或30°C培养6h。

4. 蓝白斑难以区分：

a. LB平板培养基配制的pH要准确。

b. 37°C培养时间太短。涂板48h后再进行观察。

c. IPTG浓度不对。需要优化IPTG浓度，通常IPTG最佳浓度范围为20-60μg/mL。

5. Bacmid DNA发生了降解：

a. Bacmid储存不当。Bacmid应在-20°C保存，并尽量避免反复冻融。

b. 提取大分子量的bacmid时，操作手法过于剧烈。抽提bacmid时，不要使用涡旋，不能剧烈混合，操作须尽量温和。

Version 2023030601